Ввиду того, что обмен веществ неразрывно связан с деятельностью ферментов и ни одна биохимическая реакция не происходит без их участия, совершенно очевидно, что изучение влияния различных веществ (в том числе и лекарственных препаратов) на процессы метаболизма клеток связано с изучением, их влияния на ферментативные процессы.

Ферменты относятся к глобулярным белкам и их каталитические свойства обусловлены структурой макромолекулы глобулярных белков.

Белковая глобула образуется путем сложного, но строго определенного свертывания полипептидной цепи белка, состоящей из 100 – 300 аминокислотных остатков.

Свертывание происходит так, что во внутренней части глобулы формируется гидрофобное ядро, состоящее из неполярных цепей аминокислот. Образование ядра играет важную роль не только в образовании им поддерживания пространственной структуры, но и непосредственно в каталитической активности ферментов.

В наружном слое глобулы преобладают белковые цепи аминокислот, содержащих полярные функциональные группы, кроме того имеется и некоторое число гидрофобных боковых цепей аминокислот. В результате этого поверхность белковой глобулы содержит различные функциональные группы. Они строго ориентированы друг относительно друга и в результате этого создаются благоприятные условия для связывания специфического субстрата.

Таким образом структура поверхности ферментного белка неоднородна и потенциальные каталитические возможности, которые заложены в структуре фермента, реализуются в том участке, который называется «активным центром»

Различие пространственных структур, присущих одному и тому же ферментному белку, говорит о том, что полипептидная цепь находится в постоянном движении в том случае, когда внутримолекулярные силы не связывают отдельные аминокислотные остатки с соседними сегментами цепи.

При изучении механизма ферментного катализа и структуры активных центров ферментов большое значение имеют вещества, являющиеся специфическими ингибиторами или активаторами ферментов и действующие в сравнительно малых концентрациях.

Исследование структуры активных центров фермента и механизма их действия основано на изучении кинетики и термодинамики при взаимодействии ингибиторов или активаторов различного строения с ферментами.

Исследования, проводимые в разных странах, показали, что сродство ингибиторов или активаторов к ферменту зависит от структурного соответствия молекул этих веществ активному центру фермента и сил определяющих энергию взаимодействия их с ферментом. А это в конечном итоге влияет на прочность комплекса фермент – ингибитор, фермент – активатор.

В этих взаимодействия принимают участие ковалентные водородные связи. Следует отметить, что в зависимости от условий реакций направленность действия ингибитора или активатора может изменяться. При добавлении различных субстратов может произойти индукция (изменение) ферментов.

Результаты проведенных исследований (Крицман, Першин, Опарин, Thompsa, Wannemaeher и многими другими авторами) показали, что многие индуцированные ферменты обладают весьма узкой специфичностью и обладают высокой способностью изменяться в зависимости от свойств и состава окружающей среды (температура, рН реакционной среды, концентрация ионов, присутствие химиотерапевтических веществ, антибиотиков, витаминов, кортикостероидных препаратов и др.). Исследования показали, что индуцирование ферментов является результатом действия исходного субстрата и про межуточных продуктов его обмена.

Механизм индукции ферментов связан с механизмом образования и трансформации белков. Исследования, проведенные по изучению индукции ферментов эритроцитов и лейкоцитов показали, что это явление связано с воспалительными процессами и образованием различных экссудатов.

Изучение действия ингибиторов или активаторов на ферменты, изучение индукции ферментов имеет большое значение для предупреждения и ликвидации патологических процессов. Ясное представление о механизме действия тех или иных лекарственных препаратов на ферменты клеток (тканевых или микробных) позволяет более рационально их использовать.

За последние годы были достигнуты некоторые успехи в изучении механизмов регуляции и контроля процессов обмена, протекающих в клетках.

Было показано, что для осуществления акта регуляции необходимо существование белка, обладающего специфической биологической активностью и кроме того необходимо наличие низкомолекулярного метаболизма, в присутствии которого реакция может ускоряться или тормозиться.

Предполагается, что регуляторные белки должны иметь не менее двух стереоспецифических различных неперекрывающихся рецепторных участка. К одному из них, называемому активным или каталитическим центром, может присоединяться субстрат, он определяет биологическую активность белка.

Другой центр, называемый аллостерическим, комплементарен к структуре аллостерического эффектора ( другого метаболита). Он может специфически и обратимо соединяться с аллостерическим центром белка. Образование комплекса фермент – аллостерический эффектор не активирует реакцию, в которой участвует сам эффектор, потому что соединение с эффектором приводит к изменению молекулярной структуры белка. В результате чего меняется один или несколько кинетических параметров, характеризующих биологическую активность белка. Это в свою очередь приводит к изменению свойств активного центра фермента.

Для понимания механизма действия биологических катализаторов представляет интерес метод сравнительного анализа, т.к. он дает возможность определить какие элементы белковой структуры фермента ответственны за обеспечение специфической функции.

Большой интерес представляют ферменты, управляющие реакциями дыхания и прежде всего – ферменты катализирующие окислительно – восстановительные реакции, а также ферменты, подготавливающие субстраты к окислению кислородом. При дыхании происходит окисление метаболитов, сопровождающееся выделением энергии.

При окислительно – восстановительных процессах образуется энергия, которая используется для приведения в ход ракци1й, обуславливающих процессы ассимиляции и диссимиляции.

Дегидрогеназы составляют один из наиболее важных разделов дыхательных ферментов. Они активируют водород метаболитов. Отделение от метаболита водорода и его активация называется дегидрированием.

Дегидрогеназы могут действовать как при наличии кислорода (аэробные дегидрогеназы, использующие молекулярный кислород), так и без него (анаэробные дегидрогеназы, которые использую кислород только при взаимодействии с некоторыми другими системами).

Дегидрогеназы – ферменты помогающие водородным атомам метаболитов переходить с метаболита на соответствующий акцептор. Первым акцептором водорода может быть либо кислород, либо какое – нибудь соединении. Если активированный водород какого – либо специфического субстрата не способен непосредственно реагировать с кислородом, то процесс усложняется ибо в него включаются наряду с дегидрогеназами и другие ферменты – переносчики водорода. К таким вспомогательным ферментам относятся система цитохромов, оксидазы.

Тот факт, что многие дегидрогеназные системы связаны друг с другом промежуточными переносчиками имеет большое значение для метаболизма клетки. Это обеспечивает возможность течения окислительных и восстановительных процессов в клетках и тканях не только в аэробных, но и в анаэробных условиях. Анаэробные дегидрогеназы, действующие через цитохромную систему могут угнетаться соединениями структурно родственными их субстратам. Сукцинатдегидрогеназа и холиндегидрогеназа инактивируются веществами, реагирующими с SH-группами. На основании этого предполагают, что активность этих двух ферментов зависит от наличия в их молекулах SH-групп. Сукцинатдегидрогеназа действует как многоферментная система, ее активность зависит не только от целостности каждого компонента, но также и от целостности связи между всеми компонентами. Проявление активности дегидрогеназной системы в целом нуждается в сохранении определенного уровня пространственной организации составляющих ее ферментов, т.к. поток электронов, очевидно, находится под контролем физической структуры клеточных образований.

Фермент глюкозодегидрогеназа окисляет глюкозу при участии дофосфопиридиннуклеотида или когедразы I (ДПН), цитохромоксидазы и цитохрома С. Глюкозодегидрогеназа сильно угнетается низкими концентрациями тяжелых металлов (например, ионами меди). Предполагают, что активность глюкозодегирогеназы зависит от наличия в молекуле фермента альдегидной группы.

Оксидазы, пероксидаза и каталаза относятся к ферментам – металлопротеинам.

Каталитическая активность пероксидазы и каталазы зависит от наличия железосодержащей части в порфирном кольце, а оксидаз – от наличия медьсодержащей части, связанной с характерным для них белком.

Пероксидаза является ферментом, который в присутствии перекиси водорода катализирует окисление многих фенолов и ароматических аминов. Пероксидаза очень быстро образует комплекс с перекись водорода, в процессе образования которого при присутствии перекиси водорода образуется перекись- I, перекись- II, перекись- III. Считают, что в ходе каталитического процесса железо пероксидазы остается в окисной форме.

Каталаза является ферментом, катализирующим разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Каталаза помимо расщепления перекиси водорода может участвовать и в других сопряженных окислениях. В присутствии каталазы и перекиси водорода, которая получается при действии фермента ксантиноксидазы, происходит окисление спиртов в альдегиды.

Каталаза распространена очень широко и отсутствует только у облигатных анаэробов и у некоторых микроаэрофильных бактерий. Активной группой каталазы является гематин.

Окислительно – восстановительные ферменты (дегидрогеназы, цитохромоксидазы, пероксидаза, каталаза, альдолаза, трансаминаза и др.) могут быть использованы как показатели функционального состояния бактериальных и других клеток.

Многими исследователями отмечается угнетение активности окислительно – восстановительных ферментов в зависимости от действия антибактериальных и химиотерапевтических препаратов.

Н.А. Красильников, А.Н.Полин, А.Б.Силаев, M.E.Griffith, S.Stevencon, С.Г.Смирнов, В.С.Тюрин, Ю.О.Сазыкин и другие исследователи сообщают об угнетающем действии пенициллина, стрептомицина, эритромицина, ауреомицина полимиксина, тетрацилина, левомицетина, колимицина, мицерина на активность сукцинатдегидрогеназы, глюкозодегирогеназы, пероксидазы, каталазы у стафилококков и эшерихий как чувствительных, так и резистентных к этим антибиотикам. При этом степень угнетения ферментов зависела от концентрации антибиотика, эксаозиции воздействия препарата на микробные клетки, от характеристики антибиотика, от вида возбудителя и степени его чувствительности к препарату.

Исследования, проведенные Л.М.Шмутер, показали, что грамицидин С оказывает сильно угнетающее действие на активность дегидрогеназ Cl.perfringens даже в незначительных концентрациях. Синтомицин в этих же условиях также оказал угнетающее действие на эти же ферменты, но в меньшей степени, а пенициллин и ситрептомицин активность дегидрогеназ CL.perfringens угнетали в незначительной степени. Наиболее сильно угнеталась дегидрогеназа глюкозы, затем янтарной кислоты, этилового спирта.

Изучая действие хлортетрациклина и стрептомицина на активность дегидрогеназ кишечной палочки и дизентерийных бактерий, Е.Л.Лейбфред показал, что активность дегидрогеназ глюкозы, гаоактозы и лактозы отчетливо угнеталась антибиотиками. На активность каталазы E.coli и Sh.flexneri оба антибиотика не оказали ни ингибирующего, ни стимулирующего действия.

Исследованиями Г.Н.Першина и В.В.Несвадьбы было показано, что такие препараты как пенициллин, синтомицин, левомицетин, тибон, трипафлавин, кутизон, производные пиридина оказали угнетающее действие на активность диаминооксидазы кишечных палочек и микобактерий.

Hartmann, Holje, Scwazz, изучая влияние пенициллина на биосинтез клеточных структур бактериальной оболочки, показали, что действие антибиотика многогранно, и одним из них является ингибирующее действие на гидролазы.

Исследования проведенные Н.И.Балаклиец и А.Я.Цыганенко по изучению влияния бензилпенициллина, метициллина, тетрациклина, морфоциклина взятых в отдельности, а также в сочетаниях с витаминами В-2 и В-12 на активность сукцинатдегидрогеназы, пероксидазы, каталазы и поглощения кислорода, показали, что антибиотики в сочетании с витаминами оказали более выраженное ингибирующее действие на активность сукцинатдегидрогеназы, пероксидазы и поглощения кислорода. При этом сочетания антибиотиков с витамином В-12 оказали более выраженное угнетающее действие. Более угнетающее действие на активность этих ферментов оказал метициллин. Активность каталазы в этих условиях усиливалась.

Вопросы адаптации микроорганизмов к антибактериальным препаратам, широко применяемым в клинике, являются в настоящий момент актуальными и стоят в центре внимания экспериментаторов и клиницистов.

Адаптация микроорганизмов к различным веществам, в том числе и к антибиотикам сопровождается глубокими изменениями в биологии микроорганизмов. Эти изменения являются результатом глубокой перестройки обмена веществ микробной клетки в процессе адаптации ее к антибиотикам.

Исследованиями Г.М.Шуб было показано, что адаптация брюшнотифозных бактерий к левомицетину сопровождается повышением активности глюкозодегидрогеназы и цитохромоксидазы в три раза, а у левомицетиноустойчивых штаммов дизентерийных бактерий активность дегидрогеназ глицерина, формальдегида, янтарной и молочной кислот подавляется. В меньшей степени угнетается активность дегидрогеназ этилового спирта и глюкозы.

О снижении активности дегидрогеназы, пероксидазы кислой и щелочной фосфатаз, поглощения кислорода у стафилококков, кишечной палочки устойчивых к эритромицину, колимицину, стрептомицину, неомицину, грамицидину, пенициллину, левомицетину и повышению активности каталазы в этих же условиях было показано исследованиями Н.И.Балаклиец, И.С.Буяновской, А.Ф.Мороз, А.Н.Шнеерсон и др.

Резкое снижение активности дегидрогеназ наблюдал А.Н.Апоян у выделенных от больных штаммов B.Breslau, устойчивых к хлороамфениколу и стрептомицину.

В литературе имеются указания о том, что в процессе развития устойчивости микробов известную роль играют нуклеиновые кислоты – РНК и ДНК, содержание которых при этом изменяется (В.Л.Ширяева, В.Г.Булгакова, П.Н.Мели, Н.И.Балаклиец, А.Н.Полин, C.H.Werkman,P.A.Cox, W.Hirst, I.S.Furminger и др.).

Данные, полученные разными авторами говорят о том, что нуклеиновые кислоты играют определенную роль в механизме бактериальной адаптации, однако они противоречивы.

М.А.Черткова и А.М.Хома-Лемишко исследовали содержание нуклеиновых кислот у микобактерий, устойчивых к стрептомицину, ПаСК и фтивазиду. Результаты исследований показали, что выработка лекарственной устойчивости у выделенных от больных штаммов микобактерий сопровождалась снижением общего содержания нуклеиновых кислот, главным образом за счет уменьшения содержания РНК.

P.Lazzarini и E.Santangelo показали, что хлорамфеникол оказывает угнетающее действие на синтез РНК Bac.subtilis и вызывает деградацию рибосом.

О снижении содержания РНК и увеличении содержания ДНК у стафилококков и гонококков резистентных к пенициллину, синтомицину, стрептомицину сообщили С.С.дебов и А.Г.Букринская. По их же данным у этих штаммов отмечалось снижение количества общего белка.

У кишечной палочки, устойчивой к синтомицину количество РНК не только не уменьшалось, а наоборот, увеличивалось, количество же ДНК оставалось практически на одном и том же уровне. Параллельно с увеличением количества РНК, у адаптированных к синтомицину кишечных палочек, отмечалось увеличение и количества белка.

Аналогичные данные были получены В.Н.Васильченко в отношении особей E.coli, устойчивых к стрептомицину и Н.И.Балаклиец при изучении содержания РНК и ДНК в отношении St.aureus резистентных к пенициллину и E.coli устойчивых к левомицетину.

Была зарегистрирована зависимость содержания нуклеиновых кислот от возраста микробных клеток. У молодых культур содержание РНК и ДНК было более высоким чем у старых культур (З.А.Попенкова).

Увеличение количества ДНК у кишечных палочек, обладающих устойчивостью к грамицидину, у синтомициноустойчивых и левомицетиноустойчивых штаммов Proteus Morgani отмечали З.А.Папенкова, А.М.Белозеров, К.П.Кашкин, В.П.Ямщиков.

И.М.Терешин, изучая нуклеотидный состав ДНК чувствительных и резистентных к стрептомицину штаммов Salm.Gertneri не наблюдал существенных различий в нуклеотидном составе ДНК исследуемых штаммов.

В.Г.Булгакова и А.Н.Полин результатами своих исследований показали, что изменение нуклеотидного состава ДНК зависит от вида микроорганизмов. По результатам их исследований как у грамицидиноустойчивых штаммов стафилококков и кишечной палочки, так и у чувствительных штаммов этих микробов, подвергшихся одноразовой обработке антибиотиком с разной экспозицией и концентрацией грамицидина наблюдается изменение нуклеотидов, неорганического фосфора и аминокислот в сторону уменьшения их количества. При этом чувствительные микроорганизмы под воздействием грамицидина С теряют большее количество нуклеотидов, неорганического фосфора и аминокислот, по сравнению с антибиотико-резистентными бактериями.

Аминокислотный обмен у микроорганизмов связан со многими физиологическими процессами и чрезвычайно лябилен и многообразен.

Установлено, что аминокислоты влияют на рост и развитие микроорганизмов, подавляя или стимулируя его (Е.Л.Рубан, Н.М.Вербина, С.А.Бутенко и др.). Р.М.Хомутов, Э.И.Будровский, A.Shulman своими исследованиями показали, что повышенное образование аминокислот микробными клетками и выделение их в окружающую среду является результатом нарушения нормального течения метаболических процессов и может вызываться различными причинами.

Изучая аминокислотный состав St.aureus, устойчивых к пенициллину, М.М.Гольдфарб обнаружил изменения в аминокислотном составе: по мере нарастания устойчивости стафилококков к антибиотику перестал проявляться алаин и стали обнаруживаться группа валинов и следы глицина. Другой исследователь (Н.А.Апоян) не наблюдал заметных различий в аминокислотном составе пенициллинорезистентных стафилококков, как выделенных от больных, так и полученных в лабораторных условиях, по сравнению с чувствительными к этому антибиотику стафилококками.

На основании приведенных данных очевидно, что антибиотики и химиотерапевтические препараты оказывают влияние на биохимическую активность микроорганизмов. Существенные изменения наблюдаются в активности протеаз, щелочной фосфатазы, пептидаз и других ферментов (S.Sudo and M.Drovrin, A.W.Wood and H.Tustram,G.Piggot, M.D.Sklar and Lgorini, W.J.Page, L.L.Stosk). Приобретение лекарственной устойчивости у микроорганизмов сопровождается специфическими изменениями активности окислительно – восстановительных ферментов. Параллелизм в развитии резистентности к антибиотикам и изменении состава аминокислот, позволяет высказать предположение о том, что в основе становления антибиотикорезистентности лежат изменения процессов синтеза белка микробной клетки.

Вопросы адаптации микроорганизмов к антибактериальным препаратам широко применяемым в клинике, являются в настоящий момент актуальными, т.к. лечение инфекций, вызванных антибиотикорезистентными микроорганизмами значительно затруднено.

Изучение биохимических особенностей лекарственноустойчивых микроорганизмов представляет интерес как в теоретическом, так и практическом отношении, т.к. дает возможность лучше понять механизм воздействия антибактериальных препаратов на микробную клетку, дает возможность изыскать новые методы предупреждения развития устойчивости, дает возможность разработать более эффективные методы лечения.

Безусловно, что изучение механизма действия антибиотиков только на микробную клетку не обеспечивает полностью разработки мер борьбы с инфекциями, вызванными как чувствительными, так и резистентными микроорганизмами.

Нельзя забывать о том, что антибиотики, применяемые с лечебной целью, обладают многогранной деятельностью. Их деятельность обусловлена не только эффективностью по отношению к ферментам микробной клетки.

В начало страницы