Чистой культурой называют скопление микробов одного вида на питательной среде.

Нередко для подтверждения клинически поставленного диагноза следует выделить возбудитель из исследуемого материала, взятого от больного. Необходимо доказать его причастность к развитию данной инфекции, определить его патогенность, чувствительность к антибиотикам, дезинфицирующим веществам.

Для решения всех этих вопросов выделяют чистую культуру микроорганизмов.

Исследуемый материал, используемый для выделения возбудителя, может быть разнообразным (кровь, моча, гной, испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, спинномозговая жидкость, остатки пищевых продуктов, смывы из слизистой носоглотки, рук, волоса, мокрота, перевязочный материал и пр.). Отбор исследуемого материала зависит от места локализации возбудителя.

В отобранном исследуемом материале содержатся микробы – возбудители данного заболевания и сопутствующая микрофлора, от которой необходимо избавиться.

Исходя из особенностей предполагаемого возбудителя инфекции для уничтожения сопутствующей обработки исследуемый материал может быть подвергнут первичной обработке.

В соответствии со способом первичной обработки исследуемого материала для уничтожения сопутствующей микрофлоры методы выделения чистой культуры получили такие названия:
механический;
физический;
химический;
биологический.

Например, при выделении туберкулезных бактерий, обладающих способностью выдерживать губительную для других микроорганизмов концентрацию кислоты или щелочи, мокроту больного предварительно обрабатывают одним из этих веществ, а затем производят посев на элективную питательную среду. При выделении возбудителей брюшного тифа и паратифов для ингибирования сопутствующей микрофлоры посев исследуемого материала производят в среду, содержащую желчь.

При выделении спорообразующих микробов исследуемый материал для удаления других микроорганизмов прогревают при 80 градусах 20 минут. Споры сохраняются, вегетативные клетки всех микробов погибают. Для ингибирования сопутствующей микрофлоры в некоторых случаях можно использовать температуру ниже 37 градусов. Например, при выделении возбудителя чумы посевы ставят в термостат при 25 – 30 градусов. При таком температурном режиме прежде развиваются колонии возбудителя чумы и значительно позже – колонии других микробов.

Иногда для выделения чистой культуры приходится заражать лабораторных животных. Так, при диагностике туляремии материал прежде вводится в организм морских свинок или белых мышей, а затем из крови и органов (печени, селезенки), взятых стерильно, делается посев на питательную среду. При выделении возбудителя чумы исследуемый материал со всей предосторожностью втирается в кожу белой мышки со стороны брюшка и после гибели животного из его органов (печени, селезенки) и крови, отобранных стерильно, делается посев на питательную среду. Возбудитель чумы обладает ферментом гиалуронидазой, который и обеспечивает быстрое прохождение возбудителя через кожу и слизистую.

При выделении вирусов исследуемый материал для уничтожения сопутствующей микрофлоры обрабатывается антибиотиками широкого спектра действия.

Если микробы не обладают свойствами, позволяющими применить один из перечисленных способов первичной обработки исследуемого материала, то тогда применяют механическое разобщение особей, делая посев на плотную питательную среду для получения изолированных колоний. В тех случаях, когда микробы относятся к родственным видам и дифференцируются только по набору ферментов, посев исследуемого материала делают на дифференциально – диагностические среды для облегчения поиска колонии подозреваемого возбудителя. Например, при подозрении на дизентерию посев испражнений делают на среду Плоскирева для дифференцировки колоний дизентерийных бактерий от колоний эшерихий. Первые на среде Плоскирева будут бесцветными или бледно - розовыми, колонии эшерихий – интенсивно сиреневыми. При диагностике дифтерии для дифференцировки дифтерийных бактерий посев делают на среду, содержащую теллурит калия и т.д.

При выделении чистой культуры обязательно учитываются культуральные свойства возбудителя (какая необходима питательная среда, является ли возбудитель аэробом или анаэробом, температурный оптимум, и пр.).

Получение окончательного результата зависит от особенностей размножения микроорганизмов. Так, при выделении и идентификации стафилококков окончательный результат получают на четвертые сутки, холерного вибриона – через 36 часов, бруцелл – через 9 – 29 дней, туберкулезных бактерий – через 30 – 40 дней, вируса гриппа – через 72 часа и т.д.

Обычно получение чистой культуры связано с изолированной колонией – обособленных скоплений микробов одного вида на плотной среде.

Для получения изолированных колоний, каплю исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпателем втирают материал в поверхность среды, а затем не прожигая и не переворачивая шпателя, производят посев на агар во второй и третьей чашке. При таком посеве в каждой последующей чашке микробов будет рассеиваться все меньше, что и дает возможность получить изолированные колонии. Посев можно производить и бактериологической петлей.

При выделении чистой культуры из крови (получение гемокультуры) кровь засевают изначально в жидкую питательную среду в соотношении 1:10. Кровь в объеме 10 – 15 мл засевают в 100 – 150 мл жидкой среды.

Кровь берут стерильно из локтевой вены. Разведение крови делают для того, чтобы уменьшить концентрацию лизинов, способных разрушить микробные клетки, находящиеся в крови в небольшом количестве.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка, спинномозговой жидкости и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение культуры проводится обычным способом.

Нередко, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуры заведомо из одной клетки. Такая культура называется клоном. Для ее получения чаще всего пользуются микроманипулятором. Микроманипулятор – прибор, позволяющий с помощью специальной микроскопической пипетки извлекать под контролем микроскопа одну клетку из суспензии. Микроманипулятор имеет два операционных штатива, между которыми расположен обычный микроскоп. На предметном столике микроскопа установлена влажная камера, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки. Благодаря системе винтов и рычагов перемещение микропипеток в поле зрения микроскопа осуществляют с микронной точностью.. Микропипетки вводят во влажную камеру таким образом, чтобы их концы оказались в висячей капле и под контролем глаза извлекают ими отдельные клетки. Извлеченные клетки переносят в пробирки со стерильной жидкой средой.

В начало страницы