Методика выделения и идентификации вирусов
Исследуемым материалом служат кровь, моча, смыв со слизистой носоглотки и т.д.
Материал обрабатывается в течение 1,5 – 2 часов антибиотиком широкого спектра действия для уничтожения сопутствующей микрофлоры. Для того, чтобы убедиться, что сопутствующая микрофлора погибла, по окончании инкубации исследуемого материала с антибиотиком, делают из этой смеси посев в пробирку с МПА и посев помещают в термостат на 24 часа при 37 градусах.
Пробирки с исследуемым материалом в это время хранится в холодильнике.
Только убедившись в отсутствии сопутствующей микрофлоры (по отсутствию ее роста на МПА), производят заражение исследуемым материалом культуры ткани или куриного эмбриона.
О присутствии вирусов при культивировании их в куриных эмбрионах судят по гибели эмбриона (вирус энцефалита), образованию бляшек на хорион-аллантоисной оболочке (вирусы натуральной и обезьяньей оспы), накоплению гемагглютининов в аллантоисной жидкости или тканях (вирус гриппа), накоплению инфекционного вируса (полиовирус).
При заражении исследуемым материалом культуры ткани о наличии вируса судят по проявлению цитопатического действия, по реакции гемадсорбции (вирус парагриппа), гемагглютинации (вирус гриппа) или по цветной пробе (вирус полиомиелита).
Идентифицируют вирус по антигенной структуре. Для этого пробирку с культурой ткани, в которой обнаружено присутствие вируса, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию (жидкий азот и теплая вода) для разрушения тканевых клеток и освобождения из них вирионов. После этого пробирки помещают в центрифугу и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Осколки тканевых клеток оседают на дно, а в надосадочной жидкости во взвешенном состоянии находятся вирионы.
Используя иммунные диагностические сыворотки ставят реакции торможения гемагглютинации, нейтрализации, связывания комплемента.
Для учета результата реакции торможения гемагглютинации в пробирку со смесью (иммунная сыворотка/вирионы) добавляется взвесь эритроцитов. Если вирус по антигенной структуре соответствует специфическим антителам, то происходит блокировка гемагглютинина и как результат этого – торможение склеивания эритроцитов.
Результат РСК учитывается по состоянию эритроцитов гемолитической системы. При соответствии антигенной структуры вирусов антителам образуется комплекс антиген – антитело – комплемент и как результат – отсутствие лизиса эритроцитов в гемолитической системе.
Для учета результата реакции нейтрализации вирусов заражают культуру ткани смесью (иммунная сыворотка/вирионы). Если вирус по антигенной структуре соответствует антителам, то происходит его блокировка, что препятствует адсорбции вирионов на поверхности тканевых клеток и как следствие – наблюдается отсутствие цитопатического действия вируса.
