Разработка питательных сред, и особенно плотных, для разных видов микроорганизмов позволила изучать их культуральные, биохимические, антигенные, вирулентные свойства.

Пастер для культивирования микробов использовал жидкие отвары. Первыми разработчиками плотных питательных сред были Кох и его ученики. Они первыми применили картофель, свернутую сыворотку, желатин, мясопептонный агар.

Плотные среды позволили получать чистую культуру микробов и изучать их свойства.

Стало возможным определять этиологические факторы многих инфекционных заболеваний, заняться созданием профилактических и лечебных препаратов.

Культивирование микробов на плотных питательных средах в лабораторных условиях позволило, получая чистые культуры, не только работать над созданием вакцин, диагностикумов, но и изучать спектр действия химиотерапевтических препаратов и антибиотиков, применяемых с лечебной целью, а также изучать действие химических препаратов, применяемых с целью профилактической, текущей и заключительной дезинфекции.

Постановка лабораторного диагноза связана с выяснением систематического положения микроорганизмов, полученных в чистой культуре (чистая культура – скопление микробов одного вида на питательной среде).

Получение чистой культуры часто является необходимым условием при изучении микроорганизмов, выделенных от больного.

Определение видовой принадлежности микроорганизмов включает определение целого ряда особенностей микроорганизмов: морфологии клетки, характера роста культуры на различных питательных средах, способности использовать те или иные химические соединения, отношения к температуре, рН среды, кислороду и пр. Кроме того, для определения вида у микроорганизмов часто необходимо знать продукты обмена веществ, антигенные свойства, нуклеотидный состав клеток, биохимическую активность, связанную с набором ферментов, и многое другое.

Определение всех этих признаков позволяет идентифицировать микроорганизмы.

Идентификация микроорганизмов очень важна при диагностике инфекций, установлении источников и путей передачи возбудителя.

Для того, чтобы можно было идентифицировать какой – либо микроорганизм, необходимо накопить особи в чистой культуре и в необходимом количестве.

Для выделения, культивирования, накопления и сохранения микроорганизмов пользуются питательными средами, содержащими все необходимые для микробов питательные вещества и имитирующими среду обитания микроорганизмов в естественных условиях.

Все питательные среды должны удовлетворять следующим требованиям:
1) наличие питательных веществ и факторов роста в легко усвояемой форме;
2) стерильность – отсутствие жизнеспособных микроорганизмов и спор;
3) изотоничность – одинаковое содержание минеральных солей внутри и вне клетки. Для патогенных микроорганизмов, адаптировавшихся к длительному пребыванию внутри организма человека, изотоничным считается 0,85% раствор хлорида натрия. Для микроорганизмов, обитающих, например, в океане (в соленой воде), изотоничность будет создаваться другой концентрацией солей, однако требование к изотоничности питательных сред остается;
4) оптимальное рН среды. Окислительно – восстановительный потенциал питательной среды создается ионами водорода, что способствует нормальному функционированию ферментов микроорганизмов;
5) прозрачность среды. Так как большинство бактерий одним из основных признаков роста на питательных средах является помутнение (на жидких средах – помутнение, осадок, пленка или смешанное; на плотных средах – образование колоний).

Важнейшей особенностью роста некоторых микроорганизмов на питательных средах: для лептоспир – отсутствие помутнения питательной среды (наблюдение за ростом и размножением этих микроорганизмов осуществляется при помощи фазово – контрастного микроскопа), для микоплазм и возбудителя туберкулеза – замедленный рост (помутнение или появление колоний не ранее чем через 21 сутки, а то и позже).

Питательные среды являются основой микробиологической работы и их качество нередко определяет результаты исследования. Поэтому при подборе сред следует учитывать как требования микробов в отношении веществ, необходимых для поддержания их жизнедеятельности, так и их возможность осуществлять в данных условиях обмен веществ между клеткой и средой.

Питательные среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Чтобы осуществлять биосинтез, рост и размножение, клетка должна получать извне в необходимых количествах все содержащиеся в ней элементы и должна быть обеспечена источником энергии. В соответствии с тем, какие именно элементы доставляются клетке, вещества питательной среды называют источниками углерода, азота, фосфора, серы и т.д.

Соединения, в виде которых необходимые для конструктивных целей элементы должны быть внесены в среды, определяются синтетическими способностями микроорганизмов.

Форма источника энергии определяется способом ее получения.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии отличаются чрезвычайным разнообразием, поэтому и различны их потребности в источниках питания. Этот факт необходимо учитывать при составлении питательных сред, четко представляя, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Таким образом, состав питательных сред определяется прежде всего особенностями, разнообразием обмена веществ микроорганизмов.

Необходимыми элементами питания микроорганизмов, как и других существ, являются углерод, азот, сера, фосфор, зольные элементы, а для многих микроорганизмов – различные дополнительные питательные вещества, такие как витамины, факторы роста и т.д.

Многие микроорганизмы, подобно высшим животным, помимо нормальных источников углерода, азота, минеральных солей и других элементов, служащих им источником энергии и материалом для синтеза, нуждаются еще в весьма существенных факторах роста. Особенностью факторов роста является их активность в чрезвычайно малых количествах.

Впервые фактор роста был обнаружен Вильде в 1901 году при культивировании дрожжей. Он заметил, что при засеве синтетической среды небольшим количеством дрожжей их роста не наблюдалось. Однако, если одновременно с посевом дрожжей в питательную среду внести дрожжи, убитые кипячением, рост появляется. Вильде объяснил это явление наличием в дрожжевой клетке некоторого фактора роста, названного им «БИОС».

Изучение природы БИОСа показало, что он представляет собой смесь нескольких компонентов. БИОС был расщеплен на две фракции «БИОС»-1 и «БИОС» -2. Обе фракции, взятые раздельно, не активны. Их способность стимулировать рост микробов проявляется только при совместном действии. «БИОС»-1 представляет собой инозит, «БИОС»-2 содержит гетероциклическое кольцо со свободной карбоксильной группой.

Вещества, аналогичные БИОСу, оказались необходимыми как факторы роста для многих микроорганизмов. Некоторые микроорганизмы нуждаются в добавлении к питательной среде витамина В.

По потребности в витамине В бактерии делятся на четыре группы:
а) бактерии, растущие на бульоне, лишенном витамина В. Эти бактерии не растут на синтетических средах (брюшнотифозная и дизентерийная палочки, гноеродный стафилококк);
б) бактерии , не нуждающиеся в экзогенном поступлении витамина В. Эти бактерии растут на безвитаминном бульоне и синтетических средах (кишечная палочка, холерный вибрион, синегнойная палочка, возбудитель сибирской язвы и др.). Микробы этой группы способны сами синтезировать витамин В;
в) бактерии, плохо растущие на безвитаминных средах (менингококк, возбудитель дифтерии);
г) бактерии, не растущие на безвитаминных средах (гемолитический стрептококк, пневмококк).

Установлено, что витамины группы В обладают способностью стимулировать рост и кислотообразование у пропионово – кислых и молочно – кислых бактерий.

Палочка инфлюэнцы, возбудители коклюша и мягкого шанкра нуждаются в факторе роста, состоящем из Х и Y факторов. Оба эти фактора находятся в крови, а также в картофеле и других растительных экстрактах.

Х – фактор термостабилен, он является гематином и может быть заменен некоторыми неорганическими соединениями железа, имеющими оксидную или каталазную активность. Гематин и другие соединениия железа необходимы для синтеза цитохромов, участвующих в процессах дыхания.

Y – фактор имеет витаминную природу, разрушается при автоклавировании, вырабатывается бактериями, дрожжами, клетками животных и растений.

Анаэробный микроб Bac. sporogenes использует в качестве фактора роста ненасыщенную жирную кислоту. ЕЕ наличие необходимо также и для роста Cl.botulinum и Cl. Perfringens. Это вещество образуется многими аэробными бактериями, например, брюшнотифозной, туберкулезной палочками, а также плесневыми грибами. Очевидно, это вещество необходимо для жизнедеятельности всех микроорганизмов, но анаэробные клостридии лишены способности сами его синтезировать.

Весьма активным фактором роста, имеющим универсальное биологическое распространение, является пантотеновая кислота. Амид никотиновой кислоты служит фактором роста для стафилококков. Без него стафилококки не растут на синтетических средах, содержащих гидролизованную желатину, триптофан, тирозин, цистин и глюкозу. Никотинамид синтезируется кишечной, брюшнотифозной палочками, а также холерным вибрионом.

К факторам роста относятся некоторые аминокислоты (необходимые для синтеза белка), пуриновые и пиримидиновые основания (идущие на построение нуклеиновых кислот) и др. Многие факторы роста входят в состав различных ферментов и играют роль катализаторов в биологических процессах. Вопрос о факторах бактериального роста весьма существенен. С одной стороны, он помогает понять физиологическую роль мясной воды, на которой готовятся лабораторные питательные среды для культивирования многих микроорганизмов. С другой стороны, разрешение вопроса о факторах роста позволяет более широко применять синтетические среды для культивирования микробов.

Питательные среды для одного и того же микроорганизма могут быть разными в зависимости от задач исследования. Например, среды, подходящие для длительного поддержания жизнедеятельности культур микроорганизмов, могут сильно отличаться от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена, когда требуется стимулировать отдельные стороны жизнедеятельности микробов. Особые среды нужны для образования спор и других форм жизненного цикла.

По возможности питательные среды должны быть унифицированными, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Для удобства слежения за ростом культур и контролем за загрязнением среды посторонними микроорганизмами питательные среды должны быть прозрачными.

По составу питательные среды подразделяются на натуральные, синтетические и полусинтетические.

Натуральными средами обычно называют среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения, имеющие сложный неопределенный химический состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, ткани животных, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Большинство из них используются в виде экстрактов или настоев.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для роста и развития микробов. Однако среды с неопределенным составом мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов.

Натуральные среды неопределенного состава используются, главным образом, для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

К числу сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды. В их состав наряду с соединениями известной химической природы входят вещества и неопределенного состава. Такие среды находят особенно широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

В качестве примера таких сред можно назвать мясо – пептонный бульон (МПБ), в состав которого одновременно с мясным экстрактом и пептоном, имеющими сложный состав, входят хлорид натрия, фосфорнокислый калий, а также иногда глюкоза или сахароза. К полусинтетическим относятся и картофельные среды с глюкозой и пептоном.

Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные , химически чистые соединения, взятые точно в указанных концентрациях.

Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

Питательные среды бывают элективные, дифференциально – диагностические и консервирующие.

Элективные среды были введены в микробиологическую практику С.Н.Виноградским и М.Бейеринком. Это такие питательные среды, в которых путем добавления одного или нескольких химических соединений, создаются оптимальные условия для роста и размножения одного вида микроорганизмов (или группы родственных микроорганизмов) и неблагоприятные – для всех остальных. Такие среды применяются главным образом для выделения чистой культуры микроорганизмов из мест их естественного обитания и для накопления массы культур (химический метод выделения чистой культуры). Например, питательная среда, которая представляет собой свернутую лошадиную сыворотку, является элективной средой для дифтерийных бактерий, щелочная пептонная вода – для холерных вибрионов, желчный бульон – для возбудителя брюшного тифа, печеночный бульон – для бруцелл и т.д.

Накопление микробов а элективных питательных средах во многих случаях служит важным предварительным этапом при выделении чистых культур из исходных исследуемых материалов (например, холерного вибриона или брюшнотифозных бактерий из испражнений больных или носителей и пр.).

Дифференциально – диагностические среды – это такие среды, в состав которых кроме веществ, обеспечивающих рост и развитие микроорганизмов, входят вещества, применяющиеся в качестве субстрата для определенных ферментов. По качественному изменению субстрата Определяется присутствие того или иного фермента (оценивается при помощи индикатора, реагирующего на наличие в питательной среде продуктов распада субстрата).

Каждый вид микроорганизмов характеризуется достаточно стабильным набором ферментов. Определение набора ферментов при помощи дифференциально – дагностических сред позволяет дифференцировать виды микроорганизмов. Например, кровяной агар позволяет выявить фермент гемолизин, среды Гиса – сахаролитические ферменты (карбогидразы), желатин используется для учета протеолитических свойств микробов и т.д.

Кровяной агар. О наличии фермента гемолизина судят по разрушению эритроцитов и образованию светлой зоны вокруг микробов, выросших на кровяном агаре.

Среды Гиса. О наличии ферментов – карбогидраз, расщепляющих углеводы до кислоты, свидетельствует изменение рН среды в кислую сторону и изменение цвета питательной среды. Различие в наборе ферментов может быть использовано для проверки чистоты выделяемой культуры, а также для быстрой дифференцировки одного вида от других при первичном исследовании посевов заразного материала.

Консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. В них предотвращается гибель патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. В качестве примера можно назвать глицериновую смесь, используемую для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения некоторых видов бактерий.

По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, полужидкие и сыпучие. Для выяснения физиолого – биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используются для выделения чистых культур, получения изолированных колоний, для хранения культуры и количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев. Полужидкие питательные среды, как правило, используются для более длительного хранения микробных культур. Для уплотнения сред применяют агар – агар, желатин и кремнекислый гель.

В промышленной микробиологии применяют так называемые сыпучие питательные среды. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, пропитанные питательным раствором и пр.

Питательные среды бывают простые и сложные. К числу простых жидких питательных сред относятся пептонная вода, мясо – пептонный бульон (МПБ). К плотным простым питательным средам принадлежат мясо – пептонный агар (МПА) и мясо – пептонный желатин.

Простые питательные среды, особенно МПБ и МПА, служат основой для изготовления из них более сложных сред путем добавления к ним различных веществ, повышающих питательную ценность субстрата. Например, при добавлении глюкозы получают сахарный бульон или сахарный агар; асцит – агар и асцит – бульон получают при добавлении асцитической жидкости; цельная кровь является составной частью кровяного агара и кровяного бульона, а при добавлении сыворотки крови получают сывороточные среды (агар или бульон).

Среды более сложного состава обычно предназначаются для культивирования требовательных к питательному субстрату микробов, не размножающихся на простых средах. К таким микроорганизмам относятся возбудители гонореи, дифтерии, бруцеллеза, туляремии, сифилиса, возвратного тифа, риносклеромы, туберкулеза и др.

В начало страницы