Бактериологическое исследование почвы
Важную роль в изучении почвенной микрофлоры играет экологический метод.
При изучении почвенной микрофлоры и вызываемых ею микробиологических процессов, прежде всего, изучаются сообщества микроорганизмов, участвующие в разложении растительных остатков (грибы, маслянокислые и аммонифицирующие бактерии) и минерализации (нитрифицирующие, аэробные целлюлозоразлагающие и др.).
При исследовании микрофлоры почвенных горизонтов необходимо делать разрез почвы.
При взятии проб снимают верхний слой почвы на глубину 0,5 – 1,0 см и очищают наружный слой вертикальной стенки почвенного разреза.
Пробы почвы по слоям и горизонтам необходимо брать чистым и стерильным инструментом.
При изучении микрофлоры почвы проводится количественное определение физиологических групп микроорганизмов.
Санитарными показателями почвы являются: общее микробное число, коли – титр и перфрингенс – титр.
Счет бактерий в грунте проводится двумя методами: методом разливок и прямым методом в той или иной модификации.
При определении содержания бактерий методом разливок необходимо сделать разведение почвенной суспензии, поскольку почва богата бактериями.
Для приготовления разведений необходимо иметь стерильную посуду (колбы, пробирки, пипетки) и стерильную воду или физиологический раствор.
В стерильную колбу, содержащую 100 мл стерильной воды, помещается стерильно отвешенный 1 г почвы и содержимое колбы тщательно взбалтывается.
Из полученной суспензии в пробирках со стерильной водой готовятся разведения почвы 1/100. 1/1000. 1/10 000 г.
Для этого 1 мл основной суспензии стерильно вносится в пробирку с 9 мл стерильной воды, а затем методом переката (из предыдущей пробирки в последующую с 9 мл стерильной воды) готовятся последующие разведения почвы.
После приготовления разведений делаются посевы из основной суспензии и приготовленных разведений в чашки Петри. В чашки Петри к исследуемой суспензии добавляется расплавленный и охлажденный до 42 градусов мясо – пептонный агар (МПА). Содержимое чашек Петри тщательно аккуратно перемешивается (так, чтобы агар не выливался за бортики чашки). Чашки выдерживаются на ровной поверхности до полного остывания агара. Затем все чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат.
Чашки необходимо переворачивать вверх дном для того, чтобы капля образующейся на крышке конденсационной воды не капнула на агар и не обусловила слияние выросших на агаре колоний микроорганизмов.
Слияние колоний не позволит сделать правильно количественный учет особей микробов в исследуемом объеме почвы.
Подсчет выросших колоний производится через 48 часов и через 10 суток. Из всех посевов высчитывают среднее арифметическое число на 1 г влажной и сухой почвы.
Для прямого подсчета бактерий в почве применяют различные способы, в основу которых положен метод прямого счета, разработанный С.Н.Виноградским.
По способу А.С.Разумова 1 г почвы добавляют к 500 мл стерильной водопроводной воды и встряхивают в течение 10 минут.
Полученной суспензии дают отстоятся 2 – 3 секунды и стерильной пипеткой отбирают 4 мл, которые фильтруют через мембранный фильтр.
Фильтр стерильно переносится и наносится на питательную среду в чашке Петри.
После экспозиции в термостате производится подсчет выросших колоний и делается перерасчет на 1 г почвы.
Для выявления микроорганизмов различных физиологических групп и их количественного учета пользуются методом предельных разведений.
С этой целью готовят взвесь почвы в воде (10 г почвы добавляют к 90 мл стерильной воды) и тщательно взбалтывают в течение 5 минут.
Из полученной маточной суспензии готовят разведения и производят посев на соответствующие плотные и жидкие питательные среды.
Для выявления аммонифицирующих бактерий используется пептонная вода.
Признаками развития аммонифицирующих бактерий являются помутнение питательной среды, образование пленки и осадка, положительная реакция на аммиак с реактивом Несслера.
Общее количество маслянокислых бактерий определяют путем посева на картофельную среду. Основным показателем присутствия маслянокислых бактерий является газообразование, пигментация и мацерация картофеля.
Для выявления нитрифицирующих бактерий разведения почвенной суспензии высевают на среду, содержащую аммонийно-магниевую соль фосфорной кислоты. О наличии нитрифицирующих бактерий судят по реакции на азотистую и азотную кислоты и образованию прозрачных зон на поверхности соли.
Для выявления спорообразующих анаэробов, основная почвенная суспензия предварительно прогревается при 80 градусах в течение 20 минут, после чего разведения суспензии высеваются на питательные среды. Посевы выдерживаются в термостате в анаэробных условиях.
При определении перфрингенс – титра разведения почвенной суспензии высеваются в пробирки со средой Вильсон – Блера.
Количество грибов из родов аспергиллюс и пенициллиум определяется путем посева разведений исследуемой почвенной суспензии на сусло – агар.
